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NCM_ELISA检测马铃薯Y病毒_PVY_技术的研究及应用

点击次数:3797 更新时间:2011-2-25 上午 09:25:26

来源:黑龙江省马铃薯质检中心

  NCM-ELISA 检测马铃薯Y 病毒(PVY)技术的研究及应用

  吕典秋1, 2, 李学湛1, 吕文河2*, 于德才1, 李辉3

  ( 1.黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所,黑龙江哈尔滨150086;2.东北农业大学,黑龙江哈尔滨150030;3.黑龙江省农业科学院谷物品质研究中心,黑龙江哈尔滨150086 )

  摘要:血清学方法是病毒检测的主要手段。本试验通过对马铃薯Y 病毒( PVY) 的提纯, 免疫家兔制备PVY抗血清, 并提取PYV 免疫球蛋白IgG 作为NCM- ELISA 反应为一抗, 以市售羊抗兔抗血清为二抗, 在硝酸纤维素膜( NCM) 上进行NCM- ELISA 反应检测PVY, 建立PVY NCM- ELISA 检测反应体系。试验结果显示, NCM- ELISA具有反应特异性强, 灵敏度高的优点, 检测植物叶片样品的******稀释度可达到1: 250。通过对田间40 份样品的NCM- ELISA 和DAS- ELISA 检测比较, 其检测结果吻合率达到100%。由于NCM- ELISA 方法可以将样品点在硝酸纤维素膜上, 并且可贮存几个星期或将膜送到其他实验室进行检测, 因此具有操作简单, 使用方便, 检测成本低等优点。

  关键词:硝酸纤维素膜- 酶联免疫分析; 马铃薯Y 病毒; 检测

  收稿日期:2006- 03- 08

  作者简介:吕典秋( 1973- ) , 男, 助理研究员, 现为东北农业

  大学在读博士研究生, 主要从事植物病毒分子生物学研究。

  * 通讯作者:whlu@mail.neau.edu.cn

  马铃薯Y 病毒主要由蚜虫以非持久性方式进行传播[ 1 ], 其减产幅度可达50%~80%[ 2 ]。当和PVX、PVA 病毒复合侵染时, 常能造成较大的减产[3]。依病毒株系不同, 其症状差异较大。根据其在马铃薯、烟草和其它寄主上症状严重程度, 可分为三个株系PVYO, PVYC 和PVYN[4]。利用CF RTPCR(Competitive fluorescent RT- PCR assay) 技术可以快速、准确地进行不同株系的鉴定[5]。植物病毒的诊断主要通过症状观察、指示植物接种鉴定、血清鉴定、电镜观察等方法进行诊断[ 6- 7 ]。早在1983 年Vetten 等[8]就利用ELISA 技术成功地检测到自然状态下和打破休眠薯块中的PVY 和PVA 病毒。目前, 在生产上检测马铃薯病毒的方法主要有Indirect - ELISA、DAS- ELISA 和NCM- ELISA 等。

  其中, NCM- ELISA 是一种利用硝酸纤维素膜取代微量滴定板的间接酶联免疫分析方法。

  1 材料与方法

  1.1 植物材料

  2005 年7 月, 采自哈尔滨市南岗区马铃薯生产基地的马铃薯植株叶片样品, 品种为早大白。

  1.2 抗原及抗血清

  将密度梯度离心纯化的PVY 病毒, 进行免疫家兔制备抗血清。阳性对照和DAS- ELISA 试剂盒来自国际马铃薯中心( CIP) 。

  1.3 试剂

  NBT、BCIP、羊抗兔酶标抗体、硝酸纤维素膜均购自Sigama 公司, 其它试剂为国产分析纯试剂。

  1.4 免疫球蛋白IgG 的制备和纯化

  利用硫酸铵沉淀方法进行[9]。向30 mL 离心管中加入1 mL 粗抗血清, 再加入9 mL 蒸馏水, 小心搅拌, 加入10 mL 饱和硫酸铵, 室温放置45 min。4℃, 10 000 r·min- 1 离心15 min, 弃去上清, 将沉淀重新悬浮于1 mL 透析缓冲液( 5 mM PBS, pH=7.4) 中。4℃透析, 更换3 次透析液, 每次500 mL。

  用分光光度计测量280 nm 的紫外吸收值以便计算NCM- ELISA 检测马铃薯Y病毒( PVY) 技术的研究及应用———吕典秋, 李学湛, 吕文河, 等·339·中图分类号:S532;S432.4+1 文献标识码:A 文章编号:1672- 363(5 2006)06- 0339- 04

  1 2 3 4

  ( 1- 4 号样品稀释浓度分别为1: 10, 1: 50, 1: 250, 1: 1000)

  图1 NCM- ELISA 方法检测灵敏度测试

  1

  2

  ( 第1 行为阳性样品, 第2 行为阴性样品)

  图2 NCM- ELISA 方法检测PVY 专化性测试

  1 2 3 4 5 6 7 8

  A

  B

  C

  D

  E

  图3 NCM- ELISA 方法对田间植株样品的检测

  球蛋白的确切浓度( A280=1.4, 相当于球蛋白的浓度

  1 ng·mL- 1) , 4℃贮存。

  1.5 利用NCM- ELISA 检测PVY

  1.5.1 样品采集

  在田间采集样品, 分别从待测植株的顶部、中部和底部各取一个叶片组成混合样品, 放入塑料样品袋中- 20℃冰箱保存。

  1.5.2 样品的制备

  向样品中加入10 倍样品重量的提取缓冲液( 含0.2% 亚硫酸钠的TBS, 0.02 M Tris, 0.5 MNaCl, pH=7.5) , 室温下充分研磨叶片。

  1.5.3 点样

  将膜裁成需要的大小, 使用前在TBS 中浸湿至少5 min, 将一张事先浸泡过的1# Whatman 滤纸置于斑点杂交多孔过滤加样器的抽真空板上面,将浸润的膜置于其上, 用一块封口膜封闭抽真空板上未被覆盖的区域。连接真空泵, 小心打开开关,每孔上样30 μL( 植物汁液) , 将膜从抽真空板上取下, 在室温下风干( 15~30 min) 。

  1.5.4 血清学检测

  将干燥后的膜浸泡在封闭液中( TBS+2 %牛奶+2%Triton X- 100) , 室温下摇床振荡( 50 r·min- 1) 封闭1 h。用TBS- 2 %牛奶稀释第一抗体( 工作浓度为1: 1000) 。室温下振荡( 50 r·min-1) , 孵育过夜, 用TBS+2%牛奶稀释酶标抗体。室温下振荡( 50 r·min-1) ,孵育1 h, 用TTBS( 含0.05% Tween- 20 的TBS) 洗膜4 次, 每次快速振荡( 100 r·min-1) 洗涤3 min。

  向25 mL 底物缓冲液( 0.1 M Tris, 0.1 M NaCl,0.005 M MgCl2·6H2O pH 9.5) 中加入NBT 储备液( 40 mg NBT, 1.2 mL 70% 二甲基甲酰胺) , 然后滴加BCIP 储备液( 20 mgBCIP 中加入70%二甲基甲酰胺1.2 mL) 。将膜置于NBT/BCIP 底物溶液中, 室温下振荡( 150 r·min - 1) 孵育30 min。弃去NBT/BCIP 底物溶液并用蒸馏水浸泡膜终止显色反应。

  用蒸镏水洗膜3 次, 每次3 min。

  2 试验结果

  2.1 NCM- ELISA 方法检测PVY 检出量将已知的阳性样品提取汁液按1: 10, 1: 50, 1:250, 1: 500 进行稀释, 按1.5 中NCM- ELISA 检测操作程序进行。结果显示, 可检出的******汁液稀释度为1: 250( 见图1) 。

  2.2 NCM- ELISA 方法检测PVY 专化性测试将已知的PVY 阳性样品和阴性样品分别按1: 20稀释, 点在NCM膜上进行专化性测试, 测试结果如图2。结果看出, 阳性样品有斑点颜色反应( 第1行) , 阴性样品没有颜色反应( 第2 行) , 证明所制备的抗血清和NCM- ELISA 检测反应专化性强。

  2.3 同DAS- ELISA 检测结果比较

  将田间采集的40 份植株叶片样品分别利用NCM- ELISA 和DAS- ELISA 方法进行检测, 比较两种方法的检测结果。其中利用NCM- ELISA 对40个样品的检测结果见图3, 带有紫色斑点的为阳性样品, 无紫色斑点的为阴性样品。阳性样品数为26, 检出率为65 %。利用DAS- ELISA 对同样样品的检测结果见表1, 其中, 两个对照阴性样品OD405 值分别为0.193 和0.183, 以大于阴性样品平均值+0.05 的样品作为阳性样品, 即以OD405 大于0.238 的样品视为阳性样品。和NCM- ELISA 结果相比较, 两者检测结果吻合率100%。

  ·340· 中国马铃薯, 第20 卷, 第6 期, 2006样品号OD 值结果样品号OD 值结果

  A1 1.023 + C5 0.159 -

  A2 0.992 + C6 0.172 -

  A3 1.873 + C7 1.835 +

  A4 1.795 + C8 1.902 +

  A5 0.163 - D1 0.106 -

  A6 0.086 - D2 0.160 -

  A7 0.998 + D3 0.301 +

  A8 1.001 + D4 0.415 +

  B1 0.134 - D5 0.100 -

  B2 1.102 + D6 0.136 -

  B3 1.798 + D7 2.010 +

  B4 1.821 + D8 2.021 +

  B5 0.078 - E1 1.764 +

  B6 0.096 - E2 1.657 +

  B7 1.964 + E3 0.101 -

  B8 2.001 + E4 1.030 +

  C1 0.164 - E5 1.531 +

  C2 0.173 - E6 1.623 +

  C3 1.636 + E7 1.778 +

  C4 1.705 + E8 1.696 +

  阴性样0.193 - 阴性样0.183 -

  表1 DAS- ELISA 对田间植株样品的检测

  3 讨论

  试验结果表明, NCM- ELISA 检测PVY 具有较高的灵敏度和专化性, 同DAS- ELISA 检测结果吻合率100%。目前, 脱毒种薯在生产上得到广泛应用, 田间种薯质量控制和病害监测对种薯生产起到重要作用, 而以往多数采用DAS- ELISA 技术进行病毒病检测。DAS- ELISA 技术操作比较方便, 但目前很多单位和种薯生产者不具备相应的检测条件。而NCM- ELISA 技术可将田间采集的样品进行简单处理后, 点在硝酸纤维素膜上, 然后可将膜送到有检测能力的质检部门进行检测, 膜还可进行长期保存。因此, 在生产中可进行广泛推广应用。

  [ 参考文献]

  [ 1 ] Sigvald R. The relative efficiency of some aphid species as vectors of potato virus Y [J]. Potato Research, 1984, 27: 285- 290.

  [ 2 ] 黑龙江省农业科学院马铃薯研究所. 中国马铃薯栽培学[M].

  北京: 中国农业出版社, 1994.

  [ 3 ] Hull R. Rapid diagnosis of plant virus infections by spot hybridisations

  [M]. Trends in Biotechnology, 1984.

  [ 4 ] Jones R A C. Strain group specific and virus specific hypersensitive reactions to infection with potyviruses in potato cultivars

  [J]. Annals of Applied Biology, 1990, 117: 93- 105.

  [ 5 ] Walsh K , North J, Barker I, et al. Detection of different strains of potato virus Y and their mixed infections using competitive fluorescent RT- PCR [J]. Journal of Virological Methods, 2001, 2:

  167- 173.

  [ 6 ] 张鹤龄, 孟清, 陈利民. 马铃薯卷叶病毒的免疫电镜( IBEM)快速诊断[J]. 内蒙古大学学报( 自然科学版) , 1990, 21:284- 289.

  [ 7 ] Lommel S A, McCain A H, Morris T J. Evaluation of indirect enzyme - linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses [J]. Phytopathology, 1982, 72:1018- 1022.

  [ 8 ] Vetten H J, Ehlers U, Paul H L. Detection of potato viruses Y and A in tubers by enzyme linked immunosorbent assay after natural and artificial break of dormancy [J]. Phytopathology. 1983, 108:

  41- 53.

  [ 9 ] 吕典秋, 李学湛, 白艳菊, 等. 马铃薯X 病毒( PVX) 和烟草花叶病毒( TMV) 的提纯及抗血清制备[J]. 中国马铃薯, 2000, 14

  ( 4) : 212- 214.

  Detection of Potato Virus Y by NCM- ELISA Method

  Lu Dianqiu1,2, Li Xuezhan1, Lu Wenhe2, Yu Decai1, Li Hui3

  ( 1. Viruses- free Seedling Research Institute, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin, Heilongjiang 150086, China;

  2. Northeast Agricultural University, Harbin, Heilongjiang 150030, China;

  3. Crop Quality Research Center, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin, Heilongjiang 150086, China )

  Abstr act: Serological technique as important method for viruse diagnose has been applied extensively in the field of disease detection. In this research, potato virus Y (PVY) was purified and the rabbit was immunized with

  NCM- ELISA检测马铃薯Y病毒( PVY) 技术的研究及应用———吕典秋, 李学湛, 吕文河, 等·341·

  注: 样品号与NCM- ELISA 膜上样品相对应。

  稀土旱地宝在马铃薯上的应用效果

  王效瑜1, 康有福2, 张秋燕1

  ( 1.宁夏固原市农业科学研究所,宁夏固原756000;2.固原市原州区黑城农业技术服务部宁夏固原75600 )

  收稿日期:2006- 05- 16

  作者简介:王效瑜( 1965- ) , 男, 高级农艺师, 主要从事马铃薯育种工作。

  中图分类号:S532 文献标识码:A 文章编号:1672- 363(5 2006)06- 0342- 02

  宁南山区是宁夏马铃薯的主要产区, 2006 年种植面积达14 万hm2。但干旱和病害依然是影响马铃薯生产健康发展的主要制约因素。马铃薯专用型稀土旱地宝是一种新型复合微肥[1], 含有稀土植物生长调节剂、ABT 生根粉、增产灵等微量元素, 对马铃薯发芽生根具有催生作用, 促进植株健壮生长, 增强抗旱能力, 同时还含有效能极高的内吸式农药,对晚疫病、早疫病、环腐病等通过刀切种薯传播的病害具有很好的灭杀作用。为了检验稀土旱地宝在马铃薯上应用的实际效果, 我们进行了本试验。

  1 材料与方法

  1.1 试验地概况

  试验设在宁夏固原市农业科学研究所头营科研基地, 土壤为浅黑垆土, pH=7.6~8.6, 有机质含量2.69%, 水解氮96.6 mg·L- 1, 有效磷含量34.9 mg·L- 1, 有效钾含量187 mg·L- 1。

  1.2 供试材料

  马铃薯专用稀土旱地宝是由宁夏中天技术创新工程有限公司提供; 马铃薯品种为青薯3 号。

  1.3 试验设计及方法

  稀土旱地宝用量设25 倍、50 倍、75 倍稀释液3 个处理, 浸泡刀切种薯20~30 min 后播种, 以不浸种为对照。小区面积20 m2, 随机排列, 重复3

  摘要:马铃薯专用型稀土旱地宝在宁夏南部干旱区对马铃薯刀切种薯浸种试验结果表明, 试验设计的3 种不同浓度稀释液浸种20~30 min 可使马铃薯比对照提早出苗3~5 d, 提前成熟3~10 d , 株高增加3.5~12.0 cm, 产量增加3.4%~19.9%, 并能有效预防早疫病、晚疫病、环腐病等细菌性病害。在3 种不同浓度稀释液中, 以25 倍和50 倍稀释液浸种防病抗旱增产效果显着。

  关键词:稀土旱地宝; 马铃薯; 浸种; 效果

  the purified virus of PVY for antiserum preparation. IgG of PVY was prepared as the fist antibody of NCM- ELISA

  and the commercial antiserum of goat- anti- rabbit was used as the second antibody. The reactions of ELISA were

  performed on NCM and the formal reaction system was established. The results showed that NCM- ELISA had the

  same merits of high specificity and sensitivity as DAS- ELISA. The highest detectable dilutions of extract of infected

  potato leaves was 1:250. NCM- ELISA had 100% consistency with DAS- ELISA based on comparison of

  test results from 40 potato samples collected from field. The samples can be added onto the NCM and the membrane

  can be stored for a few weeks or sent to other labs where the test can be done, so NCM- ELISA has the advantages

  of easy operation, convenience and low detection cost.

  Key Words: NCM- ELISA; potato virus Y; detection

  !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

  ·342· 中国马铃薯, 第20 卷, 第6 期, 2006研究简报

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