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检测设备与试剂
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马铃薯病毒检测试剂盒

点击次数:130767 更新时间:2011-6-7 上午 10:40:42

  马铃薯病毒检测试剂盒说明书

(DAS-ELISA)

  一、实验原理

  马铃薯病毒检测试剂盒是应用血清学检测技术检测马铃薯病毒,利用抗原(病毒颗粒)与其特异性抗体在离体条件下产生专一性反应的原理。双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(DAS-ELISA)是最为灵敏的血清学技术之一。

  二、进行DAS-ELISA实验所需的材料

  1. ELISA试剂盒中包括的材料(附录1)

  2. 1000 ml烧杯和瓶子各2个(配制洗液PBST、样品提取缓冲液)

  3. 10-15ml小烧杯6个(配制酶标溶液)

  4. 100ml 烧杯1个(配制底物溶液)

  5. 记号笔(标记样品、酶联板)

  6. 移液器(******同时有1道和8道移液器),吸头

  7. 冰箱(4℃和-20℃)

  8. 37℃ 温箱

  9. 蒸馏水

  10. 吸水纸或高级卫生纸

  11. 一个厚壁试管或平底小瓶子(用来研样)

  12. 小塑料袋(孵育时用来装酶标板)

  三、注意事项

  1. 底物有剧毒,如果您的手接触了药片或溶液,用大量的流动水彻底冲洗。

  2. 在实验过程中,不能将酶联板裸露在空气中。

  3. 各种试剂都添加了NaN3,实验过程中,一定要带手套操作,不能用手直接接触。

  4. IgG-AP保存于4℃。

  四、试验步骤

  1.配制溶液

  1.1洗液:取出1包PBS缓冲液,溶于1000mL蒸馏水中,然后加入0.5mL Tween20,混合均匀,即为洗液(PBST)。

  1.2 样品提取缓冲液:定溶至1000ml,加入0. 5ml Tween20,即为样品提取缓冲液。

  1.3阳性对照:将冻干叶片放入取样袋中,加入1ml提取缓冲液,充分研磨,然后4000rpm,离心3min,将上清液分装成105ul/支,保存在-20℃。

  1.4阴性对照:将冻干叶片放入取样袋中,加入1ml提取缓冲液,充分研磨,然后4000rpm,离心3min,将上清液分装成105ul/支,保存在-20℃。

  2.制样

  2.1 将样品(0.1~0.15g)放于塑料袋中,用记号笔标记好。检测叶片时,应选择有症状的,或从植株的顶部、中部和底部各取一片叶子合在一起。

  2.2向样品袋中加入1.0~1.5mL提取缓冲液(样品重量:样品提取缓冲液=1:10),将样品充分研磨。

  2.3 将样品袋中的溶液挤到1.5ml的离心管中,4000rpm离心3min,取上清液备用。

  2.4将已经包被好酶标板取出,用记号笔在酶标板上标记病毒名称。

  2.5向每孔中加入100 uL样品上清液。注意:每个样品用一个Tip头(不能重复使用)。

  2.6设置阴性对照孔,加入100 uL阴性对照溶液。

  2.7 设置阳性对照孔,加入100 uL阳性对照溶液。

  2.8 加完样品后,用小塑料袋将酶标板装好,放入4℃的冰箱内过夜或37℃孵育3小时。

  3.加酶标抗体溶液

  3.1准备酶标缓冲液。酶标缓冲液为5×母液,临用前用蒸馏水5倍稀释即可,现用现配。

  3.2 向酶标缓冲液中加入酶标抗体(IgG-AP),IgG-AP使用浓度为1:1000,如:0.1uL IgG-AP溶于1mL酶标缓冲液中。轻轻地混匀,避免产生气泡,此混合液称作酶标抗体溶液。(注:取用酶标抗体时应首先将离心管短暂离心一下,使粘在离心管壁上的抗体液沉于管底,易于吸取。)

  3.3 洗板:每孔加入200ul PBST,浸泡1min,倒空酶联板,立即在吸水纸上吸干残余液体。洗板3~4次。

  3.4 向每个样品孔中加入100 uL酶标抗体溶液。

  3.5 37℃下孵育2小时或4℃过夜。

  4.加底物溶液

  4.1 准备底物缓冲液:底物缓冲液为5×缓冲液,临用前用蒸馏水5倍稀释即可,现配现用。

  4.2如2.5所示,洗板3~4次。

  4.3底物溶液配制:每片底物重50mg,其中含pNPP 5 mg。1片底物(50mg)溶于5mL底物缓冲液中。

  4.4向每个样品孔中加底物溶液100uL,此步试验应快速完成,******用8道移液器加,以保证显色时间一致。然后将酶标板在室温(20~25℃)避光孵育,加入底物后5分钟开始观察结果,当阳性对照明显显色后读数值,20~60分钟结果有效。60分钟后结果不做参考。

  4.5结果判读:

  1.酶标仪读数:在OD405/490读数,一般情况下,OD405/490≥2×阴性对照的样品判断为感染病毒。

  2.肉眼判断:根据阳性对照和阴性对照的反应来判定样品是否感染病毒。阳性对照和感病的样品表现为黄色,颜色的深浅与样品中病毒的含量成正比。2小时后,将出现非特异性反应。因而,应在此之前记录结果。

  附录1:与酶联板对应样品记录

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

B

C

D

E

F

G

H

 

  附录2:检测结果登记表

  检 测 结 果

编号

症状

PVX

PVY

PVS

PLRV

PVM

PVA

 

  注:“+”表示阳性反应;“—”表示阴性反应

 

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